การตัดและเชื่อมต่อสายดีเอ็นเอเป็น DNA สายผสมนั้นไม่เพียงพอที่จะสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้ แต่ยังต้องมีวิธีการที่จะสามารถดำรง DNA สายผสมให้คงอยู่ และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่า สาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้างโปรตีนชนิดใดและศึกษาว่า DNA มียีนอะไรบ้าง สิ่งที่จำเป็นคือจะต้องเพิ่มจำนวน DNA ในบริเวณดังกล่าวให้มากพอที่จะศึกษาได้ การเพิ่มจำนวนของ DNA ที่เหมือน ๆ กันนั้นเรียกว่า การโคลนดีเอ็นเอ (DNAcloning) และหาก DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีน ก็อาจเรียกว่า การโคลนยีน (genecloning)
การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย การโคลนยีนวิธีหนึ่งที่เป็นที่นิยมกัน คือ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ DNAในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น DNA พาหะ (vector) สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด 1 ถึง 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวน ชุดของพลาสมิดก็จะเพิ่มขึ้นด้วย ซึ่งสาวนของ DNA ที่ต้องการที่แทรกไวในพลาสมิด ก็จะเพิ่มขึ้นตามโดยปริยาย หากส่วนของ DNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป
ภาพที่1การโคลนDNA
ที่มา:http://www.thaigoodview.com/node/32117
การโคลนยีนในหลอดทดลองโดยเทคนิค พอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน หรือพีซีอาร์
นอกจากการเพิ่มส่วนของ DNA โดยการแทรกส่วนของ DNA ดังกล่าวไว้ในพลาสมิดแล้ว ในปัจจุบันยังสามารถเพิ่มส่วนของ DNA ได้ในหลอดทดลองโดยไม่ต้องอาศัยเซลล์ใด ๆ อีกด้วย ในการใช้เทคนิคนี้ปัจจุบันอาศัยเครื่องมือที่เรียกว่า เทอมอไซเคลอร์ (thermocycler) ซึ่งเป็นเครื่องมือควบคุมอุณหภูมิให้ปรับเปลี่ยนตามกำหนดเวลาที่ตั้งไว้ ในการโคลนยีนโดยอาศัยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน (polymerase chain reaction :PCR) ต้องอาศัยเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรสชนิดพิเศษซึ่งสามารถทนอุณหภูมิสูงได้ เอนไซม์ชนิดนี้แยกมาจากแบคทีเรียทนร้อนซึ่งขึ้นอยู่ในน้ำพุร้อน
ปฏิกิริยาในหลอดทดลองต้องใช้1. DNA แม่แบบ ซึ่งเป็นส่วนของ DNA ที่ต้องการโคลน
2. ไพรเมอร์ (primer) เป็น DNA สายสั้น ๆ ที่จะเกาะกับส่วนของ DNA ที่ต้องการ เพื่อเป็นจุดเริ่มต้นของการสร้างสาย DNA
3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด
4. DNA พอริเมอเรส สารทั้งหมดนี้จะละลายอยู่ในสารละลายบัพเฟอร์ เพื่อควบคุมให้เกิดภาวะที่เหมาะสมต่อปฏิกิริยา การ
เกิดปฏิกิริยาในหลอดทดลองจะเริ่มจากการเพิ่มอุณหภูมิให้สูง จนสาย DNA แม่แบบที่เป็น DNA สายคู่แยกออกเป็น DNA สายเดี่ยว จากนั้นจะลดอุณหภูมิลงเพื่อให้เกิดการจับกันระหว่างไพรเมอร์ และสาย DNA แม่แบบด้วยพันธะไฮโดรเจน จากนันปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส เพื่อให้เกิดการจำลองสาย DNAโดยอาศัยสาย DNA แม่แบบ จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นอีกครั้งเพื่อแยก DNA สายคู่ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยารอบที่ 1 ออกจากกัน แล้วดำเนินกิจกรรมเช่นเดิม ทำเช่นนี้ซ้ำหลาย ๆ รอบ ก็จะได้โมเลกุลของส่วน DNA ที่ต้องการเป็นจำนวนมาก
นอกจากการเพิ่มส่วนของ DNA โดยการแทรกส่วนของ DNA ดังกล่าวไว้ในพลาสมิดแล้ว ในปัจจุบันยังสามารถเพิ่มส่วนของ DNA ได้ในหลอดทดลองโดยไม่ต้องอาศัยเซลล์ใด ๆ อีกด้วย ในการใช้เทคนิคนี้ปัจจุบันอาศัยเครื่องมือที่เรียกว่า เทอมอไซเคลอร์ (thermocycler) ซึ่งเป็นเครื่องมือควบคุมอุณหภูมิให้ปรับเปลี่ยนตามกำหนดเวลาที่ตั้งไว้ ในการโคลนยีนโดยอาศัยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน (polymerase chain reaction :PCR) ต้องอาศัยเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรสชนิดพิเศษซึ่งสามารถทนอุณหภูมิสูงได้ เอนไซม์ชนิดนี้แยกมาจากแบคทีเรียทนร้อนซึ่งขึ้นอยู่ในน้ำพุร้อน
ปฏิกิริยาในหลอดทดลองต้องใช้1. DNA แม่แบบ ซึ่งเป็นส่วนของ DNA ที่ต้องการโคลน
2. ไพรเมอร์ (primer) เป็น DNA สายสั้น ๆ ที่จะเกาะกับส่วนของ DNA ที่ต้องการ เพื่อเป็นจุดเริ่มต้นของการสร้างสาย DNA
3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด
4. DNA พอริเมอเรส สารทั้งหมดนี้จะละลายอยู่ในสารละลายบัพเฟอร์ เพื่อควบคุมให้เกิดภาวะที่เหมาะสมต่อปฏิกิริยา การ
เกิดปฏิกิริยาในหลอดทดลองจะเริ่มจากการเพิ่มอุณหภูมิให้สูง จนสาย DNA แม่แบบที่เป็น DNA สายคู่แยกออกเป็น DNA สายเดี่ยว จากนั้นจะลดอุณหภูมิลงเพื่อให้เกิดการจับกันระหว่างไพรเมอร์ และสาย DNA แม่แบบด้วยพันธะไฮโดรเจน จากนันปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส เพื่อให้เกิดการจำลองสาย DNAโดยอาศัยสาย DNA แม่แบบ จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นอีกครั้งเพื่อแยก DNA สายคู่ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยารอบที่ 1 ออกจากกัน แล้วดำเนินกิจกรรมเช่นเดิม ทำเช่นนี้ซ้ำหลาย ๆ รอบ ก็จะได้โมเลกุลของส่วน DNA ที่ต้องการเป็นจำนวนมาก
เทคนิค PCR นี้สามารถเพิ่มจำนวนโมเลกุล DNA ที่ต้องการจาก DNA แม่พิมพ์ปริมาณน้อย ให้มีปริมาณมากขึ้นในเวลาอันรวดเร็ว แต่อย่างไรก็ดีเทคนิคนี้ไม่สามารถทดแทนการโคลนยีนโดยอาศัยเซลล์แบคทีเรียในกรณีที่ต้องการยีนปริมาณมาก รวมทั้งในกรณีที่ต้องการให้ยีนดังกล่าวเกิดการแสดงออก เช่น ในการสร้างโปรตีนที่ต้องการ นอกจากนี้การเพิ่มชุดของ DNA ด้วยวิธีนี้อาจมีความผิดพลาดเกิดขึ้น เนื่องจากเอนไซม์ที่ใช้ในปฏิกิริยาบางชนิดไม่มีการทำงาน ที่เป็นการตรวจสอบความถูกต้องของลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA ที่สร้างขึ้นเหมือนกับระบบในสิ่งมีชีวิต อย่างไรก็ดีได้มีการนำเทคนิคนี้มาประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางตั้งแต่การโคลนยีนของตัวอย่างที่มี DNA ปริมาณน้อยให้มีปริมาณมากพอ แล้วจึงนำมาโคลนโดยอาศัยพลาสมิด เช่นการเพิ่มปริมาณ DNA จากซากของวอลลี่ แมมมอธ (wolly mammoth) ซึ่งสูญพันธุ์แล้ว แต่ถูกแช่แข็งไว้ที่ไซบีเรียเมื่อสี่หมื่นปีก่อน ทำให้มีโอกาสศึกษาเชิงวิวัฒนาการในสิ่งมีชีวิตที่สูญพันธุ์ไปแล้ว การตรวจสอบ DNA ปริมาณน้อย ที่ติดอยู่ตามคราบเลือด เนื้อเยื่อ หรือน้ำอสุจิที่พบในอาชญากรรมต่าง ๆ ซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการสืบสวนของกระบวนการยุติธรรม ตลอดจนการตรวจสอบ DNA จากเซลล์ของเอ็มบริโอในครรภ์ ว่ามีความผิดปกติทางพันธุกรรมหรือไม่ รวมทั้งการตรวจสอบการติดเชื้อไวรัสบางชนิด เช่น HIV เป็นต้น
1.การเพิ่มจำนวน DNA ที่เหมือนๆกันเรียกว่าอะไร
2.ถ้าการเพิ่มจำนวนของ DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีนจะเรียกว่าอะไร
3.ปฏิกิริยาในหลอดทดลองต้องใช้อะไรบ้าง
